Principio

El hematocrito o volumen de células empaquetas mide la concentración de glóbulos rojos en un volumen dado de sangre completa en un capilar, este a la vez se expresa en porcentaje de volumen total de la muestra. Una muestra de sangre completa en un tubo capilar anti-coagulada se centrifuga entre 10,000 a 13,000 rpm durante 5 minutos. Los eritrocitos se agrupan en la parte inferior del tubo celular y el hematocrito se expresa como medida de nivel comparado con el nivel plasmático. Una capa leucocitaria compuesta de glóbulos blancos y plaquetas marca la interface entre el plasma y los glóbulos rojos. El porcentaje de hematocrito se lee debajo de la capa leucocitaria. Un valor de microhematocrito puede ayudar en la evaluación del perfil de fluidos, en el reconocimiento de varios grados de anemias y el monitorio de condiciones hemorragicas agudas.

Reactivos y Equipo

• Centrifuga de microhematocrito
• Disco lector de microhematocrito
• Tubos capilares de tapa azul ( tiene EDTA)
• Tubos capilares de tapa roja (con heparina)
• Plastilina
• Equipo de Bioseguridad ( guantes, bata, lentes mascarilla…)
• Alcohol al 70% y algodón
• Lancetas o jeringas

Control de Calidad

Los hematocritos se corren por duplicado y deben estar a una semejanza de ± 1

Procedimiento

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1. Desinfectar el lugar de la punción en el dedo.
2. Realizar la punción con ayuda de una lanceta.
3. Llenar un tubo capilar con sangre procedente del lugar de punción. Se deben llenar 3/4 partes de su longitud por capilaridad, poniendo en contacto uno de los extremos con la sangre.
4. Limpiar el tubo capilar con una gasa.
5. Sellar un extremo con la plastilina.
6. Colocar el extremo de la plastilina hacia el exterior de la centrífuga para evitar que se salga la sangre por uno de los extremos del capilar.
7. Centrifugar los capilares haciendo uso de la centrífuga para microhematocrito.
8. Leer los resultados.

Resultado e interpretación

El tubo capilar debe de tener tres secciones visibles: los glóbulos rojos, la capa leucocitaria ( contiene glóbulos blancos y plaquetas) y el plasma. La lectura de los resultados del hematocrito se produce poniendo el tubo capilar centrifugado en la ranura del lector indicador plástico. La parte inferior de la columna de glóbulos rojos debe coincidir con la linea negra en el indicador plástico.

• Rotar la placa de fondo de tal forma que el 100% de la línea este debajo de la línea roja del indicador y sostener la placa del fondo en esta posición. Con el uso del agujero para el dedo, rotar la placa superior de manera que la línea espiral intercepte al tubo capilar en el espacio del plasma.
• Rotar ambos discos a la vez hasta que la línea espiral intercepte el tubo capilar en la línea de glóbulos rojos-glóbulos blancos
• El volumen de glóbulos rojos se lee como porcentaje desde el punto en el nivel directamente debajo de la línea roja del indicador plástico.

Valores normales

Recién nacidos: 53-65%

Hombres: 42- 52%

Mujeres: 37-47%

Principio

Los reticulocitos son eritrocitos inmaduros presentes en sangre periférica, lugar donde terminan su maduración a hematíes. Contienen restos de ARN y ribosomas que precipitan en presencia de los coloranes vitales como el azul de metileno o el azul de cresil brillante.

En los reticulocitos incubados con el colorante se ven imágenes gránulo-filamentosas identificables con el microscopio óptico, que corresponden a los restos de ARN.

El recuento de reticulocitos puede realizarse mediante método manual o por citometría de flujo. En el caso que nos ocupa realizaremos el recuento manual. Y para ello utilizaremos el colorante azul de cresil brillante.

Reactivos y Equipo

• Sangre anticoagulada con EDTA o, en su defecto, sangre capilar.
• Tubo de ensayo o tubo de hemólisis.
• Parafilm.
• Portaobjetos.
• Portaobjetos esmerilado.
• Pipetas pasteur.
• Colorante azul de cresil brillante (1 gramo de azul de cresil brillante y 100 ml de NaCl al 0.85%).
• Aceite de inmersión.
• Microscopio.
• Guantes
• Alcohol al 70%

Procedimiento

1. En un tubo de hemólisis debidamente rotulado, se mezclan tres gotas de sangre con tres gotas de colorante.
2. Mezclar suavemente, para evitar la hemólisis de los hematíes.
3. Dejar en reposo durante 15 minutos a temperatura ambiente.
4. Homogeneizar la mezcla.
5. Realizar un frote sanguíneo.
6. Rotular el portaobjetos.
7. Dejar secar al aire.
8. Realizar el recuento de reticulocitos utilizando el objetivo de inmersión del microscopio óptico.

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Rangos normales

Adultos: 0.5-2%

Recién nacidos: 2-6%

Interpretación de Resultados

• Interpretar bajo el microscopio usando un aumento de 100x de inmersión en aceite.
• Contabilice el número de reticulocitos en 1000 células.
• Use la fórmula % de reticulocitos = número de reticulocitos contabilizados por 1000 células * 100/1000
• Ejemplo: 35*100/1000= 35%

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En muchas ocasiones es necesario observar características citológicas que solo son evidentes después de la coloración especifica.

Fijadores

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El método de fijación utilizado depende del tipo de estructura parasitaria ( quistes, ooquistes, trofozoítos, huevos, larvas o adultos). Un excelente fijador es aquel penetra con rapidez la estructura parasitaria, detiene su metabolismo y le provoca pocos o nulos cambios morfologicos. Las soluciones fijadoras mas usadas son: formaldehído, schaudinn, alcohol polivinílivo (PVA), merthiolate-yodo-formaldehído (MIF)

Formaldehído

Se usa formaldehído al 5% para preservar esporas de microsporidios, quistes y ooquistes de protozoarios. Para huevos y larvas de helmintos se usa a 10%. Si la muestra de heces contiene quistes y huevos se recomienda usar el fijador al 10%.

• Formaldehído 5.0 ml
• Solución salina (0.85%) 95.0 ml

A fin de mantener la morfología de los parásitos en condiciones optimas se recomienda el fijador amortiguado, homogeneizar y almacenar en frasco herméticamente cerrado. cuando se utiliza el fijador a temperatura ambiente, los huevos de helmintos de pared gruesa pueden seguir se desarrollo; para asegurar que los huevos no sigan su desarrollo se recomienda calentar el fijador a 60  ℃

Schaudinn

Fijador que facilita la preservación de quistes, trofozoítos, huevos y larvas.

Solución concentrada

• Cloruro de mercurio 11.40 g
• Agua destilada 200.0 ml
• Etanol 95% 100.0 ml

Se mezcla el cloruro de mercurio (HgCl2) y el agua destilada con agitación constante; después se añade el etanol, se homogeneiza y debe ser almacenado en frascos ambar a temperatura ambiente. Esta solución concentración estable durante varios meses.

La solución de trabajo se prepara en el momento en que se va preservar la muestra con las estructuras parasitarias. la muestra con los ejemplares parasitarios se homogeneiza con la solución de trabajo se mantiene una relación 1:3 ( muestra:fijador).

Alcohol Polivinílivo (PVA)

El PVA se utiliza para fijar quistes y trofozoítos

Solución concentrada

• Ácido acético glacial 5.0 ml
• Glicerina 1.5 ml
• Solución de schaudinn 939 ml

Solución se trabajo

• Solución concentrada 100.o ml
• Alcohol polivinílico 5.0 g

Se mezcla la solución de schaudinn, en el ácido acético y la glicerina. La solución se almacena en frascos ámbar a temperatura ambiente.

En el momento de preparar la solución de trabajo, la solución concentrada se calienta a 75 ℃ y se adiciona el alcohol polivinílico, la mezcla se agita y después de almacena hasta su uso. La suspensión se conserva en buen estado por varios meses. Con el fin de fijar las estructuras parasitarias, la muestra de heces se mezcla con el fijador manteniendo una relación de 1:3.

Merthiolate-yodo-formaldehído (MIF)

El MIF es fácil de hacer. Fija y tiñe en forma simultanea.Es un buen fijador de quistes, trofozoítos, huevos y larvas.

Solución concentrada

• Tintura de Merhiolate 200.0 ml
• Formaldehído USP 25.0 ml
• Glicerina 5.0 ml
• Agua destilada 250.0 ml

Solución de yodo ( lugol)

• Yoduro de potasio 10.0 g
• Yodo cristaloide 5.0 g
• Agua destilada 100.0 ml

Solución de trabajo

• Solución concentrada 2.35 ml
• Solución de yodo 0.15 ml

Solución concentrada. El merthiolate (NUM. 99 LILLY 1:1000) se homogeneiza con el formaldehído, glicerina y agua. La solución se almacena en un frasco ámbar y puede durar hasta un año.

La solución de yodo tiene un tiempo de vida corto ( menos de una semana), por tal razón se debe preparar solo la necesaria y almacenarla en un frasco colo ámbar.

La solución de trabaja se prepara en el momento en que se va a preparar la muestra. En un recipiente se mezcla la muestra de materia fecal con la solución de trabajo, conservando una relación de 1:3-5 ( muestra:MIF).